TP : Détermination de la séropositivité d’un organisme grâce au test ELISA

ELISA est l’acronyme de : « Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay. »

Vous avez déjà entendu parler de séropositivité dans le cas du V.I.H. Or, cette notion de séropositivité s’applique à tout virus ou agent infectieux se retrouvant dans le sang d’un organisme.

Nous chercherons à déterminer si un lapin a été contaminé par un élément étranger appelé BSA (pour Sérum Albumine Bovine, une protéine bovine) ou pas.

En effet, l’organisme réagit à l’introduction de cet élément qui lui est étranger par la production d’anticorps anti-BSA: il est alors séropositif.

Parmi vous, certains ont des sérums de lapin contaminé, d’autres non. La question est donc de savoir qui travaille avec du sérum de lapin contaminé et qui travaille avec du sérum non contaminé.

Principe du test:

Un sérum de lapin contaminé par la BSA contient des anticorps Ac1 (en rouge sur l’illustration) spécifiques de l’antigène BSA.

Si ces anticorps sont effectivement présents dans le sérum, ils reconnaissent l’antigène qui a été, au préalable, fixé au fond du puits (en jaune). Des anticorps Ac2 (en gris), spécifiques des anticorps Ac1, peuvent se fixer à Ac1. Dans le protocole du test ELISA, la peroxydase, une enzyme (d’où le « E » de ELISA), est collée à l’anticorps Ac2 (l’enzyme n’a pas été représentée). Cette enzyme catalyse une réaction colorée en présence d’un substrat incolore.

Matériel :

• une barrette de 3 puits au fond desquels sont fixés des antigènes BSA = Bovin Serum Albumin
• un sérum de lapin contaminé par la BSA contenant des anticorps anti-BSA noté sérum BSA dans un tube classique
• un sérum de lapin à tester dans un tube Eppendorf (le petit en forme de cone)
• une solution d’anticorps associé à l’enzyme Ac2 dans un tube classique
• une solution d’eau distillée dans un tube classique
• une micropipette (ou équivalent)
• des gants
• des lunettes
• un chronomètre (ou téléphone)
• du papier type Sopalin
• un feutre
• une solution de lavage notée PBS tween dans un tube classique
• une solution de substrat de l’enzyme peroxydase dans un tube Eppendorf caché de la lumière par du papier aluminium

Méthode :

Repérez les puits 1, 2, et 3 grâce au feutre.

Introduisez dans chacun d’eux 80µl (utilisez les micropipettes) des produits suivants :

1. Sérum d’un lapin contaminé par la BSA,
2. Eau distillée,
3. Sérum du lapin à tester ;

Laissez incuber 5 minutes à température ambiante.

Procédez au lavage de la manière suivante :

• videz le contenu de la barrette en la retournant rapidement sur du Sopalin de manière à éviter le mélange des produits des puits 
• absorbez le liquide restant en tamponnant la barrette sur le papier 
• lavez chaque puits à l’eau distillée puis videz comme précédemment
• remplir tous les puits avec la solution de lavage et videz immédiatement comme précédemment ;

Répétez ce lavage deux fois 

Introduisez dans chaque puits 80µl de la solution Ac2

Laissez agir 5 minutes.

Videz les puits et les laver comme précédemment.

Introduisez dans chaque puits 80µl de substrat de l’enzyme peroxydase.

Attendre 5 minutes qu’une coloration apparaisse.

Résultats et interprétation:

1-Déduire des résultats obtenus si le lapin à tester a été contaminé.

2-Précisez l’intérêt du test avec l’eau distillée et avec le sérum d’un lapin contaminé.

3-Justifiez les temps d’incubation du protocole.

4-Présentez dans un tableau les résultats de la manipulation et les schémas d’interprétation correspondants. Ces schémas mettront en évidence les associations moléculaires (utilisez les symboles proposés)

5-Rangez le poste de travail.

Exemples de résultats obtenus: critiquez-les.