L’objectif de réaliser toutes les étapes de la manipulation allant de l’extraction des mitochondries à la mesure de la consommation de dioxygène en fonction de différents substrats.
Cela permet de démontrer que les mitochondries utilisent le pyruvate au cours de la respiration cellulaire visible par la consommation d’O2.
Matériel:
Matériel:
Une chaîne ExAO composée :
- d’un réacteur avec agitateur magnétique,
- d’une sonde à O2,
- d’une sonde température.
- d’un logiciel dédié (Latisbio) permettant la mesure de la concentration de dioxygène dans le réacteur;
- d’une solution tampon phosphate tamponnée à pH = 7,4
- d’une solution de pyruvate de sodium à 20% tamponnée à pH = 7,4
- d’un mortier réfrigéré avec son pilon
- bécher
- gaze
Une solution tampon phosphate
- 80 mL de solution d’hydrogénophosphate disodique (Na2HPO4) à 9,46 g.l-1 s’il est anhydre (ou 23,86 g.l-1 s’il est hydraté à 12 H2O) 20 mL de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) à 9,06 g.L-1.
- Cette solution tampon se conserve ensuite très bien au réfrigérateur
Une solution de pyruvate :
La solution de pyruvate (CH3CO CO2Na) est préparée à partir de pyruvate de sodium à 98% ramené à 20% par dilution dans le tampon phosphate à pH 7,4.
Matériel biologique : un chou fleur, le plus frais possible (un chou de bon aspect fait bien l’affaire).
Méthode :
Durée de la mesure : 2 à 4 minutes suffisent.
La première partie consiste à isoler les mitochondries
L’extraction doit se faire aux environ de 4°C donc dans un mortier sortant du congélateur en présence d’une solution tampon phosphate à pH 7,4.
- Couper suffisamment de fleurs en petits morceaux dans une coupelle
- Les mettre dans le mortier réfrigéré
- les mouiller avec 10 mL de solution tampon phosphate pH 7,4
- Broyer pendant une minute sans sable pour faire éclater les cellules végétales
- Ajouter 20 mL de la même solution tampon
- Broyer à nouveau 30 secondes
- Filtrer au dessus d’un bécher sur 4 à 5 épaisseurs de gaze
On obtient ainsi une suspension (impure) de mitochondries en ayant éliminé un maximum de débris cellulaires.
La deuxième partie consiste à faire la mesure oxymétrique de la respiration mitochondriale
- Verser 10 mL de la suspension de mitochondrie dans la cuve du bioréacteur
- Lancer l’agitation de l’agitateur magnétique
- Placer le couvercle et laisser équilibrer quelques secondes
- Introduire les sondes à O2 et à Température en s’assurant qu’elles ne touchent pas l’agitateur
- Lancer la mesure
-
* Au temps t = 30 à 40 secondes injecter 0,2 ml de glucose à 0,1 M grâce à la seringue
Appuyer sur F12 pour ajouter un marqueur
* Au temps t = 1mn30 injecter 0,2 mL de pyruvate à 20 g.l-1 tamponné à 7,4.
Ajouter un marqueur
Présenter l’enregistrement à l’aide de la fiche technique ci-dessous comme celui présenté en début de message
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