TP/Observer la photosynthèse à l’échelle du chloroplaste

D’après: https://svt-lycee-elorn.ovh/images/phototheque/metabolisme/photosynthese/fulls/hill11.png

On dit souvent que la forêt amazonienne est le poumon de la planète puisque les végétaux produirait du dioxygène, encore faut-il le prouver!

L’expérience réalisée par Mr Hill se manifeste par une libération de dioxygène, uniquement à la lumière et en présence d’un accepteur d’électrons appelé réactif de Hill.

L’avantage de cette manip est de travailler à l’échelle de l’organite, le chloroplaste, même si celui-ci est éclaté juste avant la manipulation afin de diluer l’accepteur biologique d’électrons, le NADP+.

Si l’extraction est bien réalisée, les variations de dioxygène sont spectaculaires (voir ci-dessous les résultats des élèves)

À vous de montrer que les végétaux produisent du dioxygène!

Matériel

• une suspension de chloroplastes préparés en laboratoire, à froid et à l’obscurité (il faut fermer les volets de la salle: voir « coin du labo » ci-dessous)
• un ordinateur
• un logiciel EXAO
• une sonde à O2
• une puissante lampe
• une pipette
• une propipette
• une seringue de 1ml
• une seringue de 20ml
• du papier absorbant
• un oxydant, le réactif de Hill

Méthode

• travaillez à l’obscurité
• reliez l’interface ExAO à la tour de l’ordinateur via un câble USB
• ouvrez l’ordinateur de paillasse
• ouvrez le logiciel LatisBio
• choisissez O2 dissous
• changez la durée pour 8 minutes
• installez l’agitateur magnétique dans la partie centrale du bioréacteur
• remplissez complètement le bioréacteur à l’aide de la seringue de 20ml
• enclenchez l’agitateur magnétique
• installez la sonde à dioxygène: assurez-vous qu’elle ne touche pas l’agitateur magnétique
• remplissez la seringue de 1ml de réactif de Hill : faites attention qu’il n’y ait pas de bulle d’air
• allumez la lumière et enlevez les caches…
• lancez la mesure en appuyant sur F10
• ajustez la fenêtre d’enregistrement en double-cliquant sur O2 dissous au niveau de l’axe des ordonnées
• au bout de 4 minutes, injectez DOUCEMENT le réactif de Hill
• option: au bout de 6 minutes, éteindre la lumière et mettre les caches
• pour arrêter une manip en cours, appuyez sur le bouton Echap du clavier
• recommencez tant que vos résultats ne ressemblent pas à ceux de vos camarades : voir ci-dessous

Résultats

• faites une capture d’écran votre résultat s’il est bon (vérifiez ci-dessous à l’aide des résultats obtenus par vos camarades)
• analysez-le de tête
• appelez le professeur pour en discuter

Réalisez un compte-rendu

• présentez votre résultat sous la forme que vous jugerez la meilleure
• analysez-le à l’écrit
• interprétez
• rédigez une conclusion
• envoyez votre CR via MBN

Résultats obtenus par les élèves

Le coin du labo (D’après http://labopathe.free.fr/hill.html)

Préparation de la suspension de chloroplaste (pour 10 groupes) :

Travailler à l’obscurité de la salle, volets fermés.

Le bon déroulement de l’expérience dépend étroitement de la qualité du matériel végétal utilisé. On peut prendre des végétaux comme l’épinard ou le chou vert. Il faut choisir, autant que possible, un végétal bien vert et vigoureux.

1- Préparation de la solution d’extraction des chloroplastes :
L’extraction des chloroplastes se fait à froid : les solutions ainsi que le matériel doivent être refroidis avant utilisation. De plus, cette préparation, ne se conservant pas, doit être réalisée peu de temps avant l’expérience.

Il s’agit d’un tampon phosphate pH 6.5 + saccharose.

Il est nécessaire de préparer une solution « double concentration » à partir de laquelle nous préparerons aussi une solution « simple concentration ».

Solution « double concentration » :        

• Na2HPO4, 12H2O à 0.2 mol/L soit 143.2 g/L        
• KH2PO4 à 0.2 mol/L soit 27.2 g/L       
•  Saccharose à 0.5 mol/L soit 342 g/L

– Préparer 200 mL de solution « simple concentration »: pour cela, prendre un volume de la solution double et rajouter un volume d’eau distillée.

– Dans un mortier, découper à la main puis broyer 160 g de végétal dans un peu de solution « simple concentration ».

– Ajouter le reste des 200 mL de solution « simple concentration » et continuer à broyer.

– Filtrer sur de la gaze et du coton dans un erlenmeyer.

– A ce stade, vérifier au microscope que les chloroplastes sont bien présents dans le filtrat.

– Ajouter 5 mL d’eau distillée : le choc osmotique fait éclater les chloroplastes et l’accepteur d’électron biologique, le NADP+, présent dans le chloroplaste se trouve ainsi très dilué, ce qui équivaut à sa disparition et qui justifie l’utilisation du réactif de Hill.

– Ajouter 5 mL de solution « double concentration » pour rétablir la pression osmotique de départ.

– Mettre la suspension de chloroplaste à température ambiante environ 10 min avant l’expérimentation pour qu’elle se réchauffe un peu.

2-Préparation du réactif de Hill :

Le réactif de Hill est à préparer juste avant l’expérience.       

•  K3[Fe(CN)6] à 0.2 mol/L soit 3.29 g/50ml