2nde/TP/Enregistrer les variations d’oxygène d’un extrait d’épinards dans différentes conditions

On dit souvent que la forêt amazonienne est le poumon de la planète puisque les végétaux produiraient du dioxygène…

Encore faut-il le prouver!

L’expérience réalisée par Mr Hill en 1937 (voir vidéo ci-dessous) montre une libération de dioxygène, à la lumière et en présence d’un réactif mis au point par Mr Hill, d’où son nom.

L’avantage de cette manip est de travailler à l’échelle de l’organite, le chloroplaste, même si celui-ci est éclaté juste avant la manipulation.

Si l’extraction est bien réalisée, les variations de dioxygène sont spectaculaires !

À vous de montrer que les végétaux produisent du dioxygène à la lumière !

Vous rédigerez un compte-rendu numérique que vous imprimerez à l’issue de la séance.

Ressources:

• Contrairement aux chimistes, nous utiliserons indifféremment le mot oxygène ou dioxygène pour désigner cette molécule : O₂

Matériel à vérifier :

• un extrait de cellules chlorophylliennes préparé en laboratoire, à froid et à l’obscurité (il faut fermer les volets de la salle: voir « coin du labo » ci-dessous)
• un ordinateur
• un logiciel EXAO : Latisbio
• un bioréacteur, ses bouchons et ses caches
• une sonde à O2 : attention fragile (et cher !)
• une puissante lampe
• une seringue de 1ml
• une seringue de 20ml
• du papier absorbant
• le réactif de Hill
• un agitateur magnétique, son aimant et un aimant pour attraper l’aimant !

Méthode à lire en totalité avant de commencer :

L’idée de la manip est de mesurer les variations de la quantité de dioxygène dans une enceinte fermée, le bioréacteur.

Ce bioréacteur contenant un extrait de cellules chlorophylliennes, les variations de la quantité de dioxygène ne peuvent qu’être liées au fonctionnement de l’extrait de cellules.

Or, comme l’air possède 21% de dioxygène, le bioréacteur doit être isolé de l’air grâce à la sonde à O2 et de petits bouchons.

• travaillez à l’obscurité = mettre les caches noirs
• reliez l’interface ExAO à la tour de l’ordinateur via un câble USB si ce n’est pas déjà fait
• ouvrez l’ordinateur de paillasse
• ouvrez le logiciel LatisBio
• choisissez O2 dissous
• changez la durée pour 8 minutes : écrivez 8 min
• installez l’aimant de l’agitateur magnétique dans la partie centrale du bioréacteur
• remplissez complètement la partie centrale du bioréacteur à l’aide de la seringue de 20ml: il ne doit plus rester d’air
• enclenchez l’agitateur magnétique sur vitesse moyenne
• installez la sonde à dioxygène selon les consignes du professeur : assurez-vous qu’elle ne touche pas l’agitateur magnétique !
• remplissez la seringue de 1ml de réactif de Hill
• Vous ne devez pas injecter d’air dans le bioréacteur sinon, vos mesures seront fausses: comme un médecin, tournez la seringue vers le haut; avec le doigt, tapotez le corps principal pour faire remonter la bulle d’air s’il y en a une ; puis chassez-la en appuyant sur le piston de la seringue
• posez la seringue sur la paillasse en attendant de l’injecter dans le petit trou que vous repèrerez sur le couvercle du bioréacteur
• allumez la lumière
• enlevez les caches du bioréacteur
• lancez la mesure en appuyant sur F10
• ajustez la fenêtre d’enregistrement en double-cliquant sur O2 dissous en mg/l, au niveau de l’axe des ordonnées
• au bout de 4 minutes, injectez DOUCEMENT le réactif de Hill
• observez une variation au niveau de la courbe
• au bout de 6 minutes, éteignez la lumière
• remettez les caches
• observez une variation au niveau de la courbe
• A la fin de l’enregistrement, comparez votre résultat à celui de vos camarades (Voir ci-dessous)
• si le résultat n’est pas similaire, vous pouvez, selon le temps, recommencer
• attention à ne pas perdre l’aimant de l’agitateur magnétique en vidant le bioréacteur
• discutez-en avec le professeur en cas de doute
• pour arrêter une manip en cours, appuyez sur le bouton Echap du clavier

Résultats

• faites une capture d’écran votre résultat s’il est bon (vérifiez ci-dessous à l’aide des résultats obtenus par vos camarades)
• analysez-le de tête
• appelez le professeur pour en discuter

Réalisez un compte-rendu

• présentez votre résultat sous la forme que vous jugerez la meilleure
• rajouter un titre principal
• rajouter un titre pour les axes
• légendez avec: phase sombre; phase lumineuse; injection du réactif de Hill
• expliquez en quoi les variations de la courbe prouvent que la plante produit du dioxygène à la lumière
• rédigez une conclusion
• imprimez votre CR

Résultats obtenus par les élèves

Le coin du labo (D’après http://labopathe.free.fr/hill.html)

Préparation de la suspension de chloroplaste (pour 10 groupes) :

Travailler à l’obscurité de la salle, volets fermés.

Le bon déroulement de l’expérience dépend étroitement de la qualité du matériel végétal utilisé. On peut prendre des végétaux comme l’épinard ou le chou vert. Il faut choisir, autant que possible, un végétal bien vert et vigoureux.

1- Préparation de la solution d’extraction des chloroplastes :
L’extraction des chloroplastes se fait à froid : les solutions ainsi que le matériel doivent être refroidis avant utilisation. De plus, cette préparation, ne se conservant pas, doit être réalisée peu de temps avant l’expérience.

Il s’agit d’un tampon phosphate pH 6.5 + saccharose.

Il est nécessaire de préparer une solution « double concentration » à partir de laquelle nous préparerons aussi une solution « simple concentration ».

Solution « double concentration » :        

• Na2HPO4, 12H2O à 0.2 mol/L soit 143.2 g/L        
• KH2PO4 à 0.2 mol/L soit 27.2 g/L       
•  Saccharose à 0.5 mol/L soit 342 g/L

– Préparer 200 mL de solution « simple concentration »: pour cela, prendre un volume de la solution double et rajouter un volume d’eau distillée.

– Dans un mortier, découper à la main puis broyer 160 g de végétal dans un peu de solution « simple concentration ».

– Ajouter le reste des 200 mL de solution « simple concentration » et continuer à broyer.

– Filtrer sur de la gaze et du coton dans un erlenmeyer.

– A ce stade, vérifier au microscope que les chloroplastes sont bien présents dans le filtrat.

– Ajouter 5 mL d’eau distillée : le choc osmotique fait éclater les chloroplastes et l’accepteur d’électron biologique, le NADP+, présent dans le chloroplaste se trouve ainsi très dilué, ce qui équivaut à sa disparition et qui justifie l’utilisation du réactif de Hill.

– Ajouter 5 mL de solution « double concentration » pour rétablir la pression osmotique de départ.

– Mettre la suspension de chloroplaste à température ambiante environ 10 min avant l’expérimentation pour qu’elle se réchauffe un peu.

2-Préparation du réactif de Hill :

Le réactif de Hill est à préparer juste avant l’expérience.       

•  K3[Fe(CN)6] à 0.2 mol/L soit 3.29 g/50ml