Tspé SVT/TP/Observer la photosynthèse à l’échelle du chloroplaste

On dit souvent que la forêt amazonienne est le poumon de la planète puisque les végétaux produirait du dioxygène, encore faut-il le prouver!

L’expérience réalisée par Mr Hill se manifeste par une libération de dioxygène, uniquement à la lumière et en présence d’un accepteur d’électrons que l’on appelle aujourd’hui « le réactif de Hill ».

D’après: https://svt-lycee-elorn.ovh/images/phototheque/metabolisme/photosynthese/fulls/hill11.png

L’avantage de cette manip est de travailler à l’échelle de l’organite, le chloroplaste.

Si l’extraction est bien réalisée, les variations de dioxygène sont spectaculaires (voir ci-dessous les résultats des élèves)

À vous de montrer que les chloroplastes produisent du dioxygène à la lumière lorsqu’on leur fournit le réactif de Hill !

Matériel

• Une suspension de chloroplastes préparés en laboratoire, à froid et à l’obscurité (il faut fermer les volets de la salle: voir « coin du labo » ci-dessous)
• Un microscope
• Lames et lamelles
• Supports de téléphone
• Un ordinateur
• Un logiciel EXAO
• Une sonde à O2
• Une puissante lampe
• Une pipette
• Une propipette
• Une seringue de 1ml
• Une seringue de 20ml
• Du papier absorbant
• Un oxydant, le réactif de Hill

Méthode

• Travaillez à l’obscurité
• Reliez l’interface ExAO à la tour de l’ordinateur via un câble USB
• Ouvrez l’ordinateur de paillasse
• Ouvrez le logiciel « LatisBio »
• Choisissez O2 dissous
• Changez la durée pour 8 minutes, ou 480 secondes
• Installez l’agitateur magnétique dans la partie centrale du bioréacteur
• Remplissez complètement la partie centrale du bioréacteur à l’aide de la seringue de 20ml
• Enclenchez l’agitateur magnétique
• Installez la sonde à dioxygène dans la partie centrale : assurez-vous qu’elle ne touche pas l’agitateur magnétique
• Remplissez la seringue de 1ml de réactif de Hill : faites attention qu’il n’y ait pas de bulle d’air, sinon, chassez-la comme un médecin… demandez au professeur de vérifier
• Allumez la lumière et enlevez les caches…
• Lancez la mesure en appuyant sur F10
• Pendant l’attente, montez une goutte de suspension de chloroplaste entre lame et lamelle
• A l’objectif 40, prenez plusieurs photos que vous intègrerez à votre CR.
• Ajustez la fenêtre d’enregistrement en double-cliquant sur O2 dissous au niveau de l’axe des ordonnées
• Au bout de 4 minutes, injectez DOUCEMENT le réactif de Hill
• Au bout de 6 minutes, éteignez la lumière et mettez les caches
• Pour arrêter une manip en cours, appuyez sur le bouton Echap du clavier

Résultats

• Faites une capture d’écran votre résultat s’il est bon (vérifiez ci-dessous à l’aide des résultats obtenus par vos camarades)
• Analysez-le de tête
• Appelez le professeur pour en discuter si besoin

Réalisez un compte-rendu

• Présentez votre résultat sous la forme que vous jugerez la meilleure
• Analysez-le à l’écrit
• Interprétez
• Rédigez une conclusion
• Envoyez votre CR via MBN:
  • nom et prénom
  • PdF
  • 2 pages maxi

Résultats obtenus par les élèves

Le coin du labo (D’après http://labopathe.free.fr/hill.html)

Préparation de la suspension de chloroplaste (pour 10 groupes) :

Travailler à l’obscurité de la salle, volets fermés.

Le bon déroulement de l’expérience dépend étroitement de la qualité du matériel végétal utilisé.

On peut prendre des végétaux comme l’épinard ou le chou vert.

Il faut choisir, autant que possible, un végétal bien vert et vigoureux.

1- Préparation de la solution d’extraction des chloroplastes :
L’extraction des chloroplastes se fait à froid : les solutions ainsi que le matériel doivent être refroidis avant utilisation.

De plus, cette préparation, ne se conservant pas, doit être réalisée peu de temps avant l’expérience.

Il s’agit d’un tampon phosphate pH 6.5 + saccharose.

Il est nécessaire de préparer une solution « double concentration » à partir de laquelle nous préparerons aussi une solution « simple concentration ».

Solution « double concentration » :        

• Na2HPO4, 12H2O à 0.2 mol/L soit 143.2 g/L        
• KH2PO4 à 0.2 mol/L soit 27.2 g/L       
• Saccharose à 0.5 mol/L soit 342 g/L

Préparer 200 mL de solution « simple concentration »: pour cela, prendre un volume de la solution double et rajouter un volume d’eau distillée.

Dans un mortier, découper à la main puis broyer 200g de végétal dans un peu de solution « simple concentration ».

Ajouter le reste des 200 mL de solution « simple concentration » et continuer à broyer.

Filtrer sur de la gaze et du coton dans un erlenmeyer.

À ce stade, vérifier au microscope que les chloroplastes sont bien présents dans le filtrat.

Ajouter 5 mL d’eau distillée :

• le choc osmotique fait éclater les chloroplastes
• l’accepteur d’électron biologique, le NADP+, présent dans le chloroplaste, se trouve alors très dilué, ce qui équivaut à sa disparition ce qui justifie l’utilisation du réactif de Hill.

Ajouter 5 mL de solution « double concentration » pour rétablir la pression osmotique de départ.

Mettre la suspension de chloroplaste à température ambiante environ 10 min avant l’expérimentation pour qu’elle se réchauffe un peu.

2-Préparation du réactif de Hill :

Le réactif de Hill est à préparer juste avant l’expérience.       

•  K3[Fe(CN)6] à 0.2 mol/L soit 3.29 g/50ml