Les plantes stockent l’énergie de la lumière dans de nombreuses molécules riches en énergie comme les sucres.
Mais la nuit, la photosynthèse ne peut avoir lieu et les cellules ont besoin d’énergie 24h/24…
On en déduit que les plantes font comme nous la nuit: elles respirent.
Encore faut-il le prouver!
Du coup, si une plante respire alors que peut-on mesurer ? Et comment va-t-on faire pour mesurer cette valeur ?
L’objectif de ce TP est de travailler à l’échelle de la mitochondrie (voir ci-dessous), l’organite dans lequel la respiration est censée avoir lieu.
Ce TP permet de réaliser toutes les étapes de la manipulation allant de l’extraction des mitochondries à la mesure de la consommation de dioxygène en fonction de différents substrats:
- glucose
- pyruvate (le pyruvate est issu de la coupure d’une molécule de glucose en 2 molécules plus petites)
Cela permet de démontrer que les mitochondries utilisent le pyruvate au cours de la respiration cellulaire visible par la consommation d’O2.
Matériel:
- un bioréacteur
- hachoir pour la classe
- une balance par élève
- un agitateur magnétique
- une sonde à O2
- Le logiciel Latisbio
- une solution tampon à pH 7,4
- solution de pyruvate de sodium à 20% tamponnées à pH 7,4
- solution de glucose à 0,1M grâce
- 2 seringues de 1ml
- 1 seringue de 20ml
- un mortier réfrigéré avec son marteau pilon
- un scalpel
- un bécher de 250 ml
- un cristallisoir contenant de la glace
- 2 morceaux de gaze
- 1 entonnoir
Une solution tampon phosphate
Préparation pour 100ml:
- 80ml de solution de d’hydrogénophosphate disodique (NA2HPO4) à 9,46g/l s’il est anhydre (ou 23,86g/l s’il est hydraté à 12H2O)
- 20ml de dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) à 9,06g/l
- conservation au réfrigérateur
Une solution de pyruvate
- la solution de pyruvate (CH3COCO2Na) est préparée à partir de pyruvate de sodium à 98% ramené à 20% par dilution dans la tampon phosphate à pH7,4
Matériel biologique
- 1 chou fleur le plus frais possible pour 20 élèves
Méthodes
1-Extraction des mitochondries
L’extraction doit se faire à 4°C dans un mortier sortant du congélateur en présence d’une solution tampon phosphate à pH7,4.
Elle peut se faire 1h30 avant la manipulation au blender (lire la page en lien ci-dessus)
- posez la coupelle sur la balance
- faites la tare
- pesez 40g de fleurs de chou-fleur
- coupez-le avec le scalpel
- rajoutez 50ml de la solution tampon phosphate: il s’agit d’une solution physiologique proche de celle dans laquelle vivent les cellules
- amenez votre préparation à la paillasse prof avec le hachoir
- faites broyer votre chou-fleur : à quoi ce broyage sert-il ?
- revenez à votre paillasse
- posez l’entonnoir sur le bécher de 250ml
- posez le bécher dans le cristallisoir contenant la glace
- rajoutez 4 épaisseurs de gaze sur l’entonnoir
- versez votre broyat sur la gaze
- Filtrez au dessus d’un bécher sur 4 à 5 épaisseurs de gaze
On obtient une suspension impure de mitochondries en ayant éliminé un maximum de débris cellulaires.
2-Mesure de la respiration mitochondriale
- Ouvrez le logiciel Latisbio
- Choisissez O2 dissous
- Travaillez sur 5 minutes
- Injectez 15ml de la suspension de mitochondries dans la cuve du bioréacteur à l’aide la grosse seringue
- Lancez l’agitation: mouvement doux
- Placez le couvercle sur la bioréacteur
- Laissez s’équilibrer quelques secondes
- Introduire la sondes à O2 en s’assurant qu’elles ne touchent pas l’agitateur
- Assurez-vous que le couvercle est bien fermé par ses bouchons pour éviter l’entrée d’air dans la cuve
- Lancer la mesure en appuyant sur F10
- Au bout de 30 secondes, injectez 0,2ml de glucose à 0,1M grâce à la seringue sans air (rappel: seringue à l’envers, on enlève les bulles emprisonnées)
- Appuyez sur F12 pour insérer un marqueur
- Au bout de 1,5 minutes, injectez 0,2ml de pyruvate à 20g/l tamponné à pH 7,4 sans air
- Ajoutez un marqueur (F12)
- Présentez l’enregistrement en l’annotant
Rédigez votre CR
- Nom et prénom
- En pdF
- 2 pages maxi
Fiche Technique du logiciel Latisbio
Exemples de résultats élèves:
