TP: diagnostiquer la drépanocytose grâce à une électrophorèse des protéines

Introduction générale

La drépanocytose ou anémie falciforme est l’hémoglobinopathie héréditaire la plus répandue dans le monde : elle affecte plusieurs centaines de milliers de personnes dont plus de 5 000 en France.
Dans cette maladie, lorsque la pression partielle en oxygène est faible, comme dans les capillaires périphériques, l’hémoglobine des sujets atteints a tendance à polymériser en longues fibres rigides qui déforment les globules rouges en leur conférant une forme de faucille qui les empêche de passer dans les capillaires les plus fins, freinant ou bloquant leur circulation.
L’hémoglobine anormale, S (sickle), ne diffère de l’hémoglobine normale, A, que par un seul acide aminé.
On peut distinguer les deux hémoglobines par leur mobilité électrophorétique.

La caractérisation et la comparaison de diverses protéines peut être aisément réalisée par électrophorèse sur gel d’agarose. En appliquant la technique à l’hémoglobine extraite des globules rouges d’un individu, on peut donc déterminer quelle(s) hémoglobine(s) il possède et en déduire son génotype : hétérozygote, HbA/HbS ou homozygote HbA/HbA ou HbS/HbS. Ainsi, il est possible d’étudier les relations génotype-phénotype mais aussi de construire un arbre généalogique et de faire des prévisions en génétique humaine.
En outre, l’identification des génotypes dans diverses populations permet d’établir la fréquence des allèles et de relier génétique et évolution.

Les élèves disposent de tubes témoins contenant l’hémoglobine A et l’hémoglobine S et de tubes numérotés de 1 à 6 correspondants aux hémoglobines des individus d’une famille dont l’arbre généalogique est le suivant :

Après électrophorèse, les élèves doivent déterminer les génotypes des individus 1 à 6 et en déduire les génotypes possibles pour l’individu 7.

FICHE SÉCURITÉ

L’acide acétique est un produit dangereux qui nécessite le port de gants, de lunettes et d’une blouse.
Le tampon tris Glycine et les hémoglobines ne requièrent pas de précautions d’utilisation particulières. Nous vous recommandons tout de même de manipuler ces avec des gants pour éviter tout danger.
Le colorant rouge de ponceau se manipule avec blouse, gants et lunettes.
La solution de transparisation est toxique fait de la présence de méthanol et de diacide acétone dans la composition

MATÉRIEL NÉCESSAIRE :

• Pipettes de 10/20 ml
• Poire à pipeter
• Fiole de 1 L
• Flacon de1 L
• Balance
• Erlenmeyer (ou flacon) de 250 ml (pour préparer les gels)
• Feutres permanents
• Gants
• Lunettes de protection
• Microtubes Eppendorf + portoirs
• Récipient pour bains de coloration et de décoloration
• 2 Cuves à électrophorèse pouvant contenir 3 gels chacune
• 1 générateurs de tension
• 6 gels d’agarose avec 6 puits
• Micropipettes 2-20 μL + embouts
• Eau distillée
• Poubelles de table

Dépôts des échantillons d’hémoglobines

• Vous disposez de deux solutions d’hémoglobine témoins A et B ainsi que de 4 solutions d’hémoglobine d’individus à tester par rangée de paillasse
• Chaque élève dépose 2 solutions
• Déposez 10 μL de solution d’hémoglobine par puits.
• Il faut procéder délicatement comme ci-dessous

ATTENTION : Changez d’embout de micropipette entre chaque dépôt !

Migration

Si vous disposez d’un autre type de cuve à électrophorèse, réglez l’alimentation sur 100 V et attendre que le bleu de dépôt ait atteint l’extrémité du gel pour arrêter l’électrophorèse.

Coloration

• Sortez le gel d’agarose de la cuve à électrophorèse.
• Rincez le gel à l’eau distillée.
• Placez le gel dans un récipient (cristallisoir, etc…) et recouvrez de rouge Ponceau (le gel doit être complétement immergé) pendant 15 min en agitant de temps en temps.
• Récupérez-le ronge Ponceau dans un flacon (réutilisable).
• Rincez le gel 5 fois à l’eau du robinet (remplissez et videz le récipient en retenant délicatement le gel.
• Recouvrez le gel avec de l’acide éthanoïque à 5% (le gel doit être complétement immergé) pendant 10/20 min en agitant de temps en temps (les résultats sont exploitables après 10 min de décoloration)
• Visualisez les résultats en plaçant les gels sur un fond noir avec un éclairage rasant.
  

Résultats attendus:

Source

Cliquer pour accéder à ELECPROT.pdf