TP : réaliser une électrophorèse d’ADN

Principe de l’électrophorèse d’ADN:

En milieu basique, les molécules d’ADN sont chargées négativement. Soumises à un champ électrique, elles migrent, dans un gel conducteur, de la cathode (borne négative) vers l’anode (borne positive). La distance de migration par rapport à la ligne de dépôt est caractéristique de la taille et de la charge de la molécule.

Préparation de la cuve:

1.Poser la cuve sur le papier noir (les puits dans le gel seront plus visibles).
2.Placer le gel dans la cuve sans le casser, bien parallèlement aux côtés de la cuve, les puits devant être du côté de la cathode (borne négative)
3.Verser le tampon TBE dans les deux compartiments de la cuve, le gel doit être tout juste recouvert (environ 1mm au dessus
du gel).

Dépôts d’ADN:

ATTENTION! Il faut réaliser les dépôts en stabilisant le mouvement par calage des coudes sur la paillasse et veiller à ne pas percer le fond du puits et à changer les embouts entre chaque dépôt.
1. Déposer avec une micropipette une solution d’ADN dans un puits sans débordement :
la cuve utilisée nécessite un volume d’ADN de X μL.
2. Déposer, de la même manière, dans un deuxième puits à coté du précédent la deuxième solution d’ADN.
3. Si le dépôt ne paraît pas satisfaisant (débordement par exemple), un second essai peut être réalisé dans les puits situés à côté. Dans ce cas, bien repérer les puits conservés pour l’électrophorèse

Mise en route et migration (la migration doit avoir lieu juste après les dépôts):

1.Brancher la cuve au générateur et faire migrer à 100 volts. Le pôle négatif (= cathode) doit être du côté du dépôt.
2.Vérifier le bon déroulement de l’électrophorèse : de la buée doit apparaître sur le couvercle dans les cinq premières minutes si le générateur et la cuve sont bien alimentés